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长非编码RNARNCR3在动脉粥样硬化
南京医科大学的KSha等人年在《CellDeathandDisease》期刊上（IF5.；生物2区）发表了题目为“Roleoflongnon-codingRNA-RNCR3inatherosclerosis-relatedvasculardysfunction”的文章。文章主要内容为：
动脉粥样硬化是最常见的血管疾病之一。内皮细胞（EC）功能障碍和血管平滑肌细胞（VSMC）增殖可促进动脉粥样硬化的发展。长链非编码RNA（lncRNA）参与了很多生物过程以及人类疾病。在这里，作者研究ECs和VSMCs中lncRNARNCR3的表达。RNCR3的表达在小鼠和人主动脉粥样硬化病变中高表达，并且在体外培养的EC和VSMC经ox-LDL处理时也同样如此。RNCR3敲低可加速动脉粥样硬化的发展，加重高胆固醇血症和炎症因子释放，并抑制体内的EC和VSMC增殖和迁移、加速EC和VSMC在体外的凋亡。RNCR3可充当ceRNA，并与Kruppel样因子2和miR--5p形成反馈环，以调节细胞功能。这项研究揭示RNCR3在动脉粥样硬化中具有动脉粥样硬化保护作用，对其干预将是一种充满希望的动脉粥样硬化相关血管功能障碍新疗法。
动脉粥样硬化通常以内皮损伤，炎症细胞和血管平滑肌细胞（VSMC）的积累以及细胞外脂质和纤维组织沉积为特征。在动脉粥样硬化斑块的血管造影或超声成为证据之前，内皮功能障碍被认为是动脉粥样硬化的早期标志物。通常，内皮细胞（EC）高度适应于应激环境，例如高脂血症和炎症刺激。损伤的EC迅速被驻留的增殖EC所代替。然而，持续性损伤可诱导动脉粥样硬化中的EC损伤和凋亡。动脉粥样硬化首先在受损层损害EC功能部位的发展，然后是慢性炎症反应和VSMC的增殖。VSMC被激活并在某些病理状况下恢复它们的高度增殖特征，可加速动脉壁的增厚和僵化。因此，预防EC和VSMC功能障碍的策略可以提供新的治疗方法以减少动脉粥样硬化相关的血管疾病。
长链非编码RNA（lncRNA）是一类由长于个核苷酸构成的转录物。有证据表明，lncRNA是EC和VSMC增殖、分化和细胞运动的关键调节剂。动脉粥样硬化的特征是EC和VSMC的异常增殖，迁移和促炎活化。因此，作者推测lncRNAs也是动脉粥样化形成的潜在调节剂。
视网膜非编码RNA3（RNCR3），也称为LINC，是一种长链非蛋白编码RNA，最初被报道在小鼠视网膜发育过程中动态表达。RNCR3-/-小鼠表现出神经元功能障碍和齿状颗粒细胞轴突的异常生长。尽管功能不同，神经和血管系统通常共享维持功能的调节剂。此外，作者的初步实验表明RNCR3敲低可影响眼微血管功能障碍。眼睛和心脏的脉管系统具有许多共同的特征。在这项研究中，作者证明了RNCR3在动脉粥样硬化形成中的作用。作者的研究表明，RNCR3的表达在小鼠和人主动脉粥样硬化病变中显著增加。RNCR3通过RNCR3/Kruppel样因子2（KLF2）/miR--5p调节网络对动脉粥样化的形成发挥显著的动脉粥样硬化保护作用。LncRNA-RNCR3是治疗动脉粥样硬化和相关心血管疾病的有前途的靶标。
1.细胞培养
2.血浆脂质测量
3.主动脉瓣和主动脉的脂质染色
4.外来体部分的制备
5.MTT
6.Real-TimePCR
7.油红O染色
8.免疫染色
9.统计分析
图1LncRNA-RNCR3参与眼血管功能障碍
（a-c）将4周龄的雄性ApoE-/-小鼠用含有0.15％胆固醇和20％脂肪的高脂肪饮食喂养16周。分别接受shRNA（ApoE-/-+Scr）、RNCR3shRNA病毒载体（ApoE-/-+R）皮下注射以及未经处理（ApoE-/-）。在喂食高脂肪饮食4周后开始进行shRNA注射。病毒载体每2周注射一次。使用年龄匹配的野生型C57B/6J小鼠作为对照组（C57B/6J）。进行视网膜胰蛋白酶消化以检测无细胞毛细血管的变化。红色箭头表示无细胞毛细血管。无细胞毛细血管在每个视网膜的20个随机选取、定量并平均（A，n=4，比例尺，20μm）。上述组别分别用伊文思蓝染料注入2小时。使用显微镜观察平面安装的视网膜的荧光信号传导。比例尺：μm（b）。进行Evans蓝色渗漏的定量（c，n=4）。*P＜0.05相对于C57B/6J组;＃Po0.05ApoE-/-+R对ApoE-/-Scr组。（d）四个月大的雄性C57B/6J小鼠在中心角膜上接受碱性烧伤或未经处理（Ctrl），然后分别注射RNCR3shRNA，干扰shRNA（Scr）或PBS。碱烧伤后4天，通过裂隙灯观察角膜新生血管，并定量血管面积（n=4）。
图2LncRNA-RNCR3在主动脉粥样硬化病变中高表达，其敲低加剧了体内动脉粥样硬化
（a）通过qRT-PCR确定5个月大的雄性ApoE-/-和C57B/6J小鼠的主动脉中的RNCR3的表达情况。WT，野生型C57B/6J小鼠。E/L损伤和E/L正常：分别具有来自apoE-/-小鼠的动脉粥样硬化损伤或无损伤（正常）的主动脉段（*Po0.05）。（b）在人主动脉的动脉粥样硬化病变和非病变主动脉内膜组织中检测到RNCR3的表达情况（*Po0.05）。（c-f）给四周龄雄性ApoE-/-小鼠喂食含有0.15％胆固醇和20％脂肪的高脂肪饮食16周，皮下注射shRNA（Scr）、RNCR3shRNA病毒载体（R）或PBS。在喂食高脂肪饮食4周后开始进行shRNA注射。病毒载体每2周注射一次。然后选取小鼠主动脉进行油红O染色。冠状动脉的动脉粥样硬化病变定量表示为相对于总主动脉区域的病变百分比（C和D，每组n=6）。在PBS、干扰shRNA和RNCR3shRNA注射的小鼠中主动脉窦的代表性油红O染色。比例尺：μm。主动脉窦损伤定量显示为与PBS注射组相比的变化。*po0.05对PBS注射组（e和f，n=6每组）
图3RNCR3敲低加重高胆固醇血症并增加炎症因子释放
给四周龄雄性ApoE-/-小鼠喂食含有0.15％胆固醇和20％脂肪的高脂肪饮食16周。进行shRNA（Scr）或RNCR3shRNA病毒载体（R）或PBS的皮下注射。（a，b）在注射PBS-，干扰shRNA和RNCR3shRNA的小鼠中分别检测血浆胆固醇和甘油三酯水平（每组n=6）。（c）将分别注射PBS-，干扰的shRNA和RNCR3shRNA的小鼠的混合血浆（每组n=6）进行蛋白质液相色谱（FPLC）脂蛋白谱分析。（d-f）通过ELISA（每组n=6）定量PBS-，干扰shRNA和注射RNCR3shRNA的小鼠的TNF-α，CCL2和IL-6蛋白的血浆水平。HDL，高密度脂蛋白;LDL，低密度脂蛋白;VLDL，极低密度脂蛋白。
图4RNCR3敲低影响体内的EC和VSMC功能
（a）在野生型C57B/6J小鼠的胸主动脉中进行RNCR3（绿色）的原位杂交和CD31（红色）或SMA（红色）的免疫染色。（b）进行RNA-FISH以检测EC和VSMC中RNCR3的表达。核：蓝色;RNCR3：红色;微管蛋白：绿色。检测微管蛋白作为细胞质标记以显示细胞边界。（c）将HUVEC或VSMC暴露于致动脉粥样化ox-LDL（25μg/ml）指定的时间段。进行qRT-PCR以检测RNCR3水平。（d-f）ApoE-/-小鼠喂食高脂肪饮食4周，后12周进行皮下注射RNCR3shRNA腺病毒（继续用高脂肪饮食）。注射shRNA或PBS作为对照。通过CD31免疫染色（CD31，红色;DAPI，蓝色）确定颈动脉的内皮覆盖面积（d）。通过对PCNA和CD31的双重免疫染色测定颈动脉的内皮增生情况。（e）。通过对PCNA和SMA的双重免疫染色测定颈动脉的血管平滑肌细胞的增殖情况（f）。
图5RNCR3的敲低在体外影响EC和VSMC的功能
HUVECs用（Scr）siRNA，RNCR3siRNA或未处理的（WT）转染48小时。通过MTT的方法检测细胞活力。（a，n=4）。Ki67免疫荧光染色和定量分析显示RNCR3敲低抑制HUVEC增殖。（b，n=4）。（c）用（Scr）siRNA，RNCR3siRNA或未处理的（WT）转染HUVEC，然后经ox-LDL（25μg/ml）处理48小时。将未经ox-LDL处理的组作为对照组（Ctrl）。使用Hoechst染色分析凋亡细胞并定量。使用钙荧光素-AM/PI染色分析死亡或死亡细胞。绿色，活细胞;红色，死亡或垂死的细胞。（e，f）用siRNA，RNCR3siRNA转染HUVECs或不经处理，然后经ox-LDL（25μg/ml）处理48小时。从这些实验组收集培养基，与VSMC共培养24小时。通过transwell和Ki67染色检测VSMC的迁移、增殖情况。（e，f）显示了细胞迁移和细胞增殖的代表性图像和定量结果。
图6EC-VSMC通信由含RNCR3的外来体介导
（a-c）将HUVEC经ox-LDL处理24小时或未处理（CL）。在经DNaseI，RNaseA或PK（a）处理后的中对照（CL）培养基以及EC条件培养基（CM）分别检测RNCR3水平。通过Ki67染色或transwell迁移测定检测VSMC增殖（b）或迁移（c）情况。（d）检测与对照（CL）培养基或用DNaseI，RNA酶A或PK处理的EC条件培养基（CM）孵育的VSMC中的RNCR3水平。（e，f）将EC-CM超速离心以分离旋转沉淀（Pellet）中的组分或剩余的上清液（Super）。在沉淀和上清部分（e）中检测RNCR3水平。检测与对照（CL）培养基，总的或分级分离的EC-CM孵育6小时的VSMC中的RNCR3水平（f）。（g）经ox-LDL诱导RNCR3后，分别用凋亡抑制剂Z-VAD-FMK（ZVAD）或N-SMase抑制剂GW处理HUVEC。将VSMC与从上述HUVEC组分离的囊泡孵育12小时。检测VSMC中的RNCR3水平。（h）用RNCR3siRNA、分别siRNA转染HUVECs24小时，或不经处理，后分别经ox-LDL（25μg/ml）处理12小时或不做处理。检测HUVEC或外来体中的RNCR3水平。（i，j）VSMC与来自siRNA或RNCR3siRNA转染的EC的培养基（CM）共同处理或共培养24小时。将未经任何治疗的VSMC作为对照组。使用Ki67染色或transwell迁移测定检测VSMC增殖（i）或迁移（j）。
图7RNCR3通过作为ceRNA调节内皮细胞功能
（a）用不同的miRNA转染HUVEC，或者不经处理（Ctrl）48小时。进行qRT-PCR以检测RNCR3水平。（b）用Ago2siRNA和siRNA分别转染HUVEC，或不进行处理（Ctrl）。使用qRT-PCR检测miR--5p或RNCR3水平。（c）使用TargetScan预测miR--5p的靶基因：KLF2，并确定KLF2上miR--5p结合位点的位置。（d）KLF2（RLuc-KLF2-WT）或其突变体（RLuc-KLF2-Mut）分别与miR--5p，miRNA模拟物共转染或不经处理。通过双荧光素酶测定法检测荧光素酶活性。（e-h）HUVECs如图所示。通过MTT法（g）检测细胞活力。（f，h）显示了Ki67染色的代表性图像以及定量分析数据。
基于体内和体外的证据，作者推测RNCR3上调是动脉粥样硬化期间的潜在应激反应。动脉粥样硬化优先在EC功能受损的部位发展。高脂血症诱导EC的损伤和凋亡，导致动脉内皮的功能障碍。内皮完整性通常通过用增殖和健康的EC替代损伤的EC来维持。内皮功能完整性的丧失在从病变开始到斑块破裂的动脉粥样硬化的所有阶段都具有不可或缺的作用。作者表明动脉粥样硬化或ox-LDL处理导致RNCR3水平的显着增加。RNCR3的敲除抑制损伤动脉中的EC再生，降低EC增殖，并间接影响VSMC增殖和迁移。因此，RNCR3敲低加速动脉粥样硬化的发展，最终加重高胆固醇血症和炎症反应。
作者表明lncRNARNCR3通过竞争结合到miR--5p与KLF2信号通路中并实现共调节。在动脉粥样硬化期间，RNCR3显着上调，这减轻了miR--5p的表达效应，从而上调miR--5p靶基因KLF2的水平。该调节环保持内皮功能中的相对平衡以抵抗促动脉粥样硬化应激。miR--5p显示为转录后调节物。LncRNA-RNCR3在转录水平上作为基因组调节子起作用。调节环还整合了涉及动脉粥样硬化的转录和转录后调节网络。
总之，作者报告了RNCR3在动脉粥样化形成中具有动脉粥样硬化保护作用。RNCR3敲除增加了EC和VSMC的功能障碍，并加重动脉粥样硬化。因此，RNCR3水平的上调似乎是一种新的治疗策略，以防止高胆固醇血症诱导的EC和VSMC功能障碍和动脉粥样硬化的发展。
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