敲除GPR改善高胆固醇血症和动脉粥

要点：

GPR调节人和小鼠的血浆胆固醇水平

在没有GPR的情况下肝SREBP2活性和VLDL分泌率降低

GPR通过ERK1/2调节SREBP2信号通路

GPR缺乏症可预防Ldlr-/-小鼠的动脉粥样硬化

本文的通讯作者是哈佛医学院的副教授，他主要的研究领域是代谢疾病，包括T2D和冠状动脉疾病。擅长的手段是用遗传方法找到对代谢疾病的遗传易感性基因，再在组织和疾病中进行验证。发表的文章有一篇从遗传学角度脂肪细胞代谢和胰岛素信号扰动，年还发了一篇CirculationResearch研究人前脂肪细胞和脂肪细胞中胰岛素抵抗候选基因的功能筛选。

本文摘要：人类遗传研究已经揭示了许多与血浆脂质水平相关的易感基因，但是它们的生理和分子功能尚未得到充分表征。本篇文章证明孤儿G蛋白偶联受体（GPR）通过激活细胞外信号调节激酶（ERK）信号传导途径来促进肝固醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）的活性，从而调节肝极低密度脂蛋白（VLDL）分泌，并随后降低循环中低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和甘油三酸酯（TG）的水平。表型上，雄性和雌性LDLR-/-在GPR敲除后，主动脉粥样硬化病变分别减少90％和70％。这些发现概述了GPR/ERK轴在全身性胆固醇代谢中的调节作用，并表明靶向GPR可能是降低血浆胆固醇水平和动脉粥样硬化的有效策略。

Figure1.首先作者发现GPR缺失可以降低胆固醇

A.作者通过遗传学的手段确定出人GPR为调节血浆胆固醇水平的易感基因。

B.此外，rs-G与人血中GPR的表达增加有关（从基于生物库的综合组学研究的份血液样本中进行了分析）（图1B）。综上所述，这些数据表明GPR可能会促进人体循环胆固醇水平。

C.接着作者探究GPR在小鼠中的功能。用CRISP/CAS9体系构建了全身敲除Gpr小鼠和flox小鼠

D。首先作者发现Grp在内脏脂肪和肝脏中表达量最高。

EF接着作者给敲除和不敲除小鼠给予正常饮食，发现敲除鼠小鼠血浆中TC水平降低，

G同时HPLC检测了血浆中HDL、LDL和VLDL的水平，敲除鼠中也分别下降了。

作者同时用雄鼠和雌鼠进行验证，在雌鼠中也观察到TC的降低，以及脂蛋白的降低。

S1CD与LDL-C水平降低一致,循环中apoB的水平也降低。

以上结果表明GPR在人和小鼠的循环胆固醇水平调节中起着一致的作用。

以上结果是禁食16h得到的

GH值得注意的是，在短期禁食6h或禁食16h后再喂食6h后，Gpr敲除小鼠的血浆TC水平也降低了，作者同时也观察在其他高脂饮食下，是否仍保留这一降胆固醇作用。S1I，在WD下，降低胆固醇的幅度更大，达到30%。在HFD饮食下也会降低TC。

同时也观察到不管是长期禁食还是短期禁食或是HFD情况下血浆中TG水平也是降低的。这些发现表明，靶向GPR可能是降低血浆胆固醇和TG水平的有效策略。

Figure2作者探讨为什么会降低TC，原因是发现GPR敲除后会降低SREBP2的活性和VLDL的分泌速率

降低的TC可能是由于肠吸收受损，肝胆固醇从头合成减少，肝脏VLDL分泌减少，或增加的组织清除TC的效率或者增加胆汁外排.

S2A-2C首先发现敲除鼠和对照相比表明食物摄取和活动能力都无差异

S2D-2E体重体脂肪无差异，证明TC降低和体重和和脂肪无关。

S2F-2I粪便排泄物中的TC/TG含量没有显着差异因此，因此也不是由于肠道吸收差异导致的TC水平降低。

血浆稳态TC水平会是由几个过程决定的，肝脏VLDL的分泌，LDL和乳糜微粒残留物在外周和肝脏中的清除，以及HDL诱导的胆固醇逆向转运

HDL生物合成基因Apoa1和Abca1的肝表达无差异,胆汁胆固醇分泌的ABCG5也不变。

SJ-K为了探究是由于乳糜微粒分解代谢速率提高所致，我们通过将一定剂量的橄榄油口服递送给小鼠进行了脂质耐受性测定，并追踪血浆TG水平4小时。血浆TG水平的动态变化没有观察到显着差异。

为了测量是否是由于VLDL分泌导致的，在小鼠中给予抑制VLDL清除的抑制剂），并监测血浆TG和TC2小时。2AB，在敲除小鼠均均存在着降低的TG和胆固醇的分泌.

SC-F,但是肝脏中TGTC水平不变，表明尽管VLDL分泌率降低，肝TG/TC的体内稳态仍能得到很好的维持。

SNOP由于肝脏VLDL分泌的减少也可能关系到脂肪组织脂解过程，作者为了验证是否Grp也参与调节了脂肪脂解，用脂肪特异性小鼠验证，发现血浆中TGTC不变

S2CDE同时建立肝脏特异性敲除小鼠，发现TC降低，TG和TC的分泌率也降低。

以上结果表明敲除小鼠中血浆LDL-C和TG水平的降低很可能是由于肝脏VLDL分泌率降低所致。

尽管VLDL的分泌速率降低，但是涉及VLDL分泌的基因都没变。为了进一步鉴定GPR调控的信号通路，作者通过使用三个不同的数据库进行了无偏基因集富集分析（GSEA），即反应组通路基因集，标志性基因集和KEGG通路基因集。

2HI发现敲除鼠中TC的合成通路降低

2J并且qpcr结果也证明胆固醇合成的限速酶Hmgcs1明显降低。

2KL同时观察到一种重要的胆固醇合成转录因子SREBP2表达显著下调

以上表明GRP敲除小鼠中VLDL分泌降低，可能是由于SREBP2调节的胆固醇合成降低

Figure3作者接下来探讨GPR如何调节肝脏中的胆固醇生物合成途径。

S2V，发现小鼠在空腹时间延长16小时后未观察到胆固醇生物合成基因的下调，但fasting16h再refeeding6h条件下，在缺乏GPR的情况下观察到胆固醇生物合成基因的下调。一些研究表明SREBP2活性和其下游靶基因HMGCR和LDLR在fasting时降低，但在refeeding时持续激活，表明存在一种feeding应答的信号途径调节胆固醇合成。

3A使用KEGG基因集进行的基因集富集分析显示，有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号是敲除小鼠肝脏refeeding后显着下调的途径之一

3BCDE同时观查到ERK1、2在feeding时显著下调，而持续16hfasting时，无差异

3GH是在细胞中验证，为了进一步测试GPR是否在肝细胞中``feeding’’后直接激活ERK1/2信号传导，我们在HepG2细胞中过度表达了人GPR，发现ERK1/2的含量大大增加。

以上证明GPR对ERK的调节依赖于feeding条件。

Figure4.ERK1/2信号在调节肝胆固醇代谢中的体内生理功能尚不清楚

4ABC，作者首先在体外Hepg2细胞上验证，饥饿后的血清治疗，这会导致SREBP2和下游靶基因上调，再给予ERK1/2的抑制及处理PD，可以看到SREBP2和靶基因被抑制下来，并且在不同细胞系上都重复验证了。

之后使用这个抑制剂PD在体进行验证，这时候采用的模型时fast16h再refeed6h，此时，SREBP2和血浆TC水平应该是增加的，但是再给予PD处理组的小鼠，会发现SREBP2和靶基因抑制，以及血浆中TC水平也降低，尤其是在PD10mg/kg的时候

4EFGH，除了使用抑制剂PD观查到这样的结果，还用CRISPR技术敲低ERK1或ERK2或者都敲掉。发现在敲低ERK2的时候才发生SREBP2和其靶基因的降低。

以上在体和体外实验证明了ERK2调节SREBP2和血浆TC水平。

图5.GPR在短期禁食时调节小鼠的ERK/SREBP2轴

Figure6作者探究GPR的生理功能

已经报道LDLR对SREBP2途径是反馈抑制在维持肝脏和血液中胆固醇水平，为了证明GRP对SREBP2的抑制不依赖于LDLR活性。

为了验证这一假设，如6ACE所示，在LDLR缺失的小鼠上再敲低，能观察到血浆TC水平仍然降低，尤其在WD饮食下，TC水平下降幅度更大。

6BD同时，血浆中VLDL组分上的胆固醇水平也降低。

S6AB，血浆中TG和VLDL组分中的TG也降低。

6FGH，在LDLR清除背景下GRP的敲除小鼠肝脏的SREBP2和ERK也是被抑制的。以及SREBP2下游的胆固醇合成基因也是下调的。这些数据表明，对GPR清除后TC的降低和对SREBP2的调控作用不依赖LDLR活性。

IJKLM，在Grp敲除小鼠上的这种降低TC的作用，是否会降低AS。作者给予WD16W，发现LDLR敲除背景的GPR敲除鼠明显改善斑块，不管在雄鼠还是雌鼠上。

Figure7为了检查成年Ldlr敲除小鼠肝GPR的清除是否会实质上降低血浆TC水平，向小鼠注射了靶向GPR的AAV8-shRNA

7ABC，并且在注射后给予chowdiet2W，再给予WD饮食6周，在如图A所示的时间点取血检测血浆TC，可以看出在注射AAV后血浆中的TC在不同时间点都是降低的。

7DE，在WD处理6W时间点上，检测VLDL上的胆固醇也是降低的，胆固醇合成基因也下调。

S7，以及在注射AAV后，血浆中TG及VLDL中TG也是降低的。

总结：

1.逻辑清晰严谨、方法可学习；

2.在验证血浆中TC降低时，作者考虑了几个方面：肠吸收受损，肝胆固醇从头合成减少，肝脏VLDL分泌减少，增加的组织清除TC的效率或者增加胆汁外排，设计实验时可以学习；

3.数据量庞大：文中所有动物实验均同时在雄鼠和雌鼠上观察；细胞实验也同时在不同细胞系上验证；技术上：细胞实验应用抑制剂和CRISPR/CAS9技术；动物上除了应用全身/脂肪/肝脏特异性敲除小鼠，也用了AAV病毒验证。

还可以深入的地方：1.作者在持续禁食16h后，在敲除GPR后仍可观查到TC水平的降低，但是ERK和SREBP2的活性并没有改变，所以在fasting的时候应该存在GPR调节的其他机制去调控TC.2.GPR究竟是如何调节ERK信号通路的。可能通过配体激活下游级联反应？或者和其他同路crosstalk调节ERK?

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