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单细胞RNA测序揭示了小鼠动脉粥样硬化疾
今天这篇文章是年6月发表于CirculationResearch上，题为Single-CellRNA-SeqRevealstheTranscriptionalLandscapeandHeterogeneityofAorticMacrophagesinMurineAtherosclerosis。
概述
文章从Ldlr-/-小鼠的未患病（摄食）和动脉粥样硬化（高脂饮食11周）的主动脉中提取的总主动脉CD45+细胞进行了单细胞RNA测序，聚类分析挑选出13个不同的主动脉细胞簇。差异基因表达和基因本体论富集分析揭示了区分出三个巨噬细胞亚群和MoDC的特定基因表达模式，并揭示了每种细胞类型的推定功能。其中，TREM2hi巨噬细胞在脂质代谢和分解代谢中具有特殊的功能，并呈现出让破骨细胞的基因表达特征，暗示着在病变钙化中的作用。文章数据揭示了动脉粥样硬化中主动脉巨噬细胞和MoDC的转录态势和表型异质性，并鉴定了先前无法识别的巨噬细胞群体及其基因表达特征，表明了其独特的功能。
背景
巨噬细胞广泛存在于机体的各个脏器和组织,又称为单核吞噬细胞系统(mononuclearphagocytesystem,MPS)。在疾病状态下，慢性炎症可导致巨噬细胞反应异常重塑，并导致其表型发生变化.在动脉粥样硬化中，巨噬细胞功能失调是疾病发病机理的基础。文章假定动脉粥样硬化动脉包含具有特定功能的几个巨噬细胞亚群。这些亚群的精确身份很难被识别，因此研究人员通过有限数量的标记物的表达对这些细胞亚群进行分类。
方法
1、FACS分选CD45+主动脉细胞，进行scRNA测序。
2、CellRanger软件及R包Seurat进行数据分析。
结果
1、基于单细胞RNA-seq的动脉粥样硬化相关免疫细胞群的鉴定
从Ldlr-/-小鼠主动脉中筛选出了CD45+白细胞，聚类选择了13种不同的细胞簇。说明动脉粥样硬化的主动脉既包含真正的常驻巨噬细胞，又包含募集的细胞，一旦浸入主动脉，它们就会表现出相似的基因表达谱。因此，将常驻的巨噬细胞群称为Res样（Residentlike）Mφ。
2、动脉粥样硬化主动脉巨噬细胞群体中的基因表达异质性
巨噬细胞代表了动脉粥样硬化主动脉中最大的细胞群，占总CD45+细胞的28.9％，并且该细胞群可以分解为炎症性（47.0％），Res样（34.4％）和TREM2hi巨噬细胞（18.6％）（图2A）。热图给出了相对于其他群体而言，每个群体中表达最丰富的基因（图2B）。炎性Mφ在已报道的具有促动脉粥样硬化作用的各种基因中显示高表达（例如Ccl，Il1b，Il1a15，Nlrp，Cebpb17，Egr，Phlda），也表达了几种巨噬细胞活化反馈抑制剂（Nfkbiz，Nfkbid，Ier），同样也表达具有抗动脉粥样硬化功能（编码Tristerasprolin14，Nr4a的Zpf36）的基因。Res样Mφ表达的基因与主动脉驻留巨噬细胞（F13a1，Lyve15,13），趋化因子（Ccl24，Ccl9）和与M2样巨噬细胞相关的基因（Folr2，Cbr2，Mrc13）相关。有趣的是，类似ResMφ还显示了Pf4（编码CXCL4）（一种通常被认为是巨核细胞/血小板特异性的促动脉粥样化趋化因子）和Txnip（与硫氧还原蛋白相互作用的蛋白）的同质表达，与巨噬细胞和VSMC炎症激活和动脉粥样硬化有关。除Trem2外，TREM2hiMφ还显示了独特的基因表达特征，Cd9，Spp1（编码骨桥蛋白），Hvcn1和几种组织蛋白酶（Ctsd，Ctsb，Ctsz）（图2B-C）。
为了进一步了解在动脉粥样硬化主动脉中发现的这三个巨噬细胞亚型的潜在功能异质性，研究人员对Res样Mφ，炎性Mφ和TREM2hiMφ进行了GO项分析（图3）。发现TREM2hiMφ具有其他两个巨噬细胞亚群所没有的特定功能，例如有机物和细胞分解代谢过程，脂质代谢过程，胆固醇外排和氧化应激的调节力。
3、主动脉单核细胞衍生的树突状细胞/树突状细胞的转录谱
观察到一簇来自单核细胞的树突状细胞/树突状细胞作为主要的动脉粥样硬化相关细胞群。其与在炎症性和Res样Mφ中GO分析结果相似（图4A）。为了进一步揭示将巨噬细胞与MoDC/DC区别开的基因表达模式，我们在全部巨噬细胞中进行了成对的差异基因表达分析[即与MoDC/DC相比，炎性Mφ+Res-likeMφ+TREM2high-Mφ]分别显示和个基因分别在Mφ和MoDC/DC中显着富集（图4B）。热图分析显示了在MoDC/DC中富集但在巨噬细胞中不富集的基因（图4C）。
4、在晚期动脉粥样硬化中，类似Res的Mφ，炎性Mφ，TREM2hiMφ和MoDC/DC会填充主动脉
对高脂饲养20周后从Ldlr-/-小鼠主动脉分离出CD45+白细胞进行了单细胞RNA-seq分析，t-SNE可视化进行基因表达变异和无监督聚类（图5A-D）。发现炎症Mφ，Res-LikeMφ，TREM2hiMφ和MoDC/DC的群体，基因表达模式与在HFD检测11周时观察到的细胞亚群高度相似（图5C-D）。
5、Res-likeMφ，炎性Mφ，TREM2hiMφ和MoDC/DCApoe-/-小鼠的主动脉
提取巨噬细胞簇的单细胞基因表达数据，并通过t-SNE可视化进行基因表达变异性和聚类分析（图6A-C）。该分析揭示了三个不同的巨噬细胞种群（APOE-Mφ1，APOE-Mφ2和APOE-Mφ3），分别占总巨噬细胞的41.8％，39.2％和19.0％。数据表明，炎性Mφ，ResLike-Mφ，TREM2hiMφ也在Apoe-/-小鼠的动脉粥样硬化主动脉中分布。
6、检测鼠和人类动脉粥样硬化病变中的炎症性Mφ，Res-Like-Mφ和TREM2hi-Mφ富集基因
IL-1β在Lgals3+（MAC2+）病变巨噬细胞中大量表达（图7A）。CD9+巨噬细胞优先表达在坏死区域的内部和附近，而不是大部分的斑块巨噬细胞泡沫细胞（图7B）。在人类病变巨噬细胞中检测到了富含炎性基因（TNFα，TNFSF9），Res样基因（CXCL4，LYVE-1，TXNIP）和TREM2hi-Mφ（TREM2，骨桥蛋白）基因的产物表达（图7C）。
总结
使用单细胞RNA测序调查动脉粥样硬化中的白细胞浸润情况，研究人员发现了动脉粥样硬化主动脉中的三个主要巨噬细胞亚群，包括一个常驻亚群和两个特定于动脉粥样硬化的亚群，并建立了它们的基因表达特征。此外，还分析了动脉粥样硬化相关的主动脉MoDC/DC的基因表达特征及其与巨噬细胞的区别。该篇文章为探索骨髓细胞群及其在动脉粥样硬化中发挥的功能提供了新的研究思路。
